Flavonoides e Antocianos

Disciplina de Farmacognosia I, UFPR

Os flavonoides são compostos naturais, derivados da benzo-γ-pirona, apresentando a estrutura química C₆-C₃-C₆. Ocorrem no estado livre ou, mais comumente, como O-glicosídeos, embora exista um número considerável de C-glicosídeos. São conhecidos mais de 2000 flavonoides, sendo o maior grupo de compostos fenólicos naturais encontrados na natureza e, por isso, são usados como compostos marcadores quimiossistemáticos. Seu nome deriva do termo em latim flavus, que significa amarelo, embora a flavona pura seja incolor.
            Terapeuticamente sua função não está ainda claramente esclarecida. O grupo é conhecido pelos seus efeitos anti-inflamatórios, antialérgicos e vasoprotetores (tratamento de tromboses). Rutina e hesperidina são importantes flavonoides empregados em tratamentos de fragilidade capilar.

 

As antocianidinas são flavonoides estruturalmente relacionados com a flavona. O nome é derivado do grego antho-, flor, e kyanus-, azul. São pigmentos encontrados na seiva, sendo que a cor do órgão é determinada pelo pH da seiva. O azul de determinadas flores e o vermelho da rosa podem ser devidos ao mesmo glicosídeo, em pH diferente.

Os frutos do faveiro são ricos em rutina, sendo a droga de escolha para esta aula.

Aula Prática

Pesquisa de flavonoides

1. Extração

• Ferver, em banho-maria, 1 g de faveiro com 10 ml de solução de EtOH a 70% por 2 min;
• Filtrar por algodão.

 

2. Identificação genérica de flavonoides

Reação de Shinoda

• Colocar cerca de 2 ml do extrato alcoólico em um tubo de ensaio e adicionar mais ou menos seis fragmentos de Mg metálico;
• Adicionar 1 ml de HCl conc., observando se desenvolve coloração.

 

Reação com cloreto de alumínio

• Umedecer áreas diferentes de uma tira de papel de filtro com o extrato alcoólico obtido;
• Colocar sobre uma das regiões uma gota de solução de AlCl₃ a 5% e comparar a fluorescência sob luz ultravioleta (ondas longas).

Pesquisa positiva → intensificação de fluorescência com mudança de cor para verde amarelado.

Reação de Taubouk

• Colocar cerca de 3 ml do extrato em uma cápsula de porcelana e levar ao banho-maria até secura;
• Esfriar e umedecer o resíduo com algumas gotas de acetona;
• Adicionar alguns cristais de ácido bórico e de ácido oxálico;
• Evaporar novamente em banho-maria até a secura, evitando aquecimento prolongado;
• Dissolver o resíduo em 3 ml de éter etílico e observar sob a luz ultravioleta.

 

Reação de Pew

• Colocar cerca de 3 ml do extrato em uma cápsula de porcelana e levar ao banho-maria até secura;
• Adicionar 3 ml de metanol e transferir o conteúdo da cápsula para um tubo de ensaio;
• Adicionar uma pequena porção de zinco metálico e adicionar mais ou menos três gotas de HCl conc.

3. Identificação de antocianidinas

O cloreto de cianidina, pigmento responsável pela coloração violeta do repolho-roxo e pela coloração vermelha das rosas, é um sal vermelho (pH ácido) e sua cor varia conforme o pH da solução.

Em solução fracamente básica (pH 8), toma a coloração violeta devido à formação da anidrobase, de estrutura quinoide. Em repouso, a solução torna-se incolor pela conversão da anidrobase para a pseudobase, onde perde-se a estrutura quinoide. Quando esta solução incolor passar para uma alcalinidade maior (pH 12), a cor passa a azul devido à formação do ânion da anidrobase. Se esta solução torna-se ácida (pH < 4), a cor passa a vermelho por causa da regeneração do cloreto de cianidina. Por outro lado, em repouso e solução alcalina, todos os compostos são convertidos em chalcona, de cor amarela.

• Colocar 15 g de repolho roxo, bem lavado e cortado em pedaços pequenos, em um béquer;
• Adicionar 100 ml de água;
• Extrair o pigmento por fervura durante 15 min;
• Filtrar para uma proveta e completar com água para 50 ml;
• Preparar 18 tubos de ensaio contendo soluções padrão conforme tabela abaixo;
• Colocar 2 ml da solução de repolho roxo em  cada um dos tubos.

Preparação dos tubos contendo solução padrão:

 

Apostila de Aula Prática de Farmacognosia UEL

Objetivo: Verificar a presença ou ausência de flavonoides na matéria-prima vegetal.

A)Preparo do extrato:

• Pesar 10g da droga vegetal seca.
• Adicionar 90 mL de álcool etílico a 75% ou hidroetanólico (1:1) e colocar no turbolizador por 15 mnutos.
• Filtrar com algodão. Completar o volume para 100 mL com o mesmo etanol.

B)Reação de Shinoda ou Reação de Cianidina

• Colocar 2 mL do extrato hidroetanóico (a 10% da droga vegetal) em uma cápsula de porcelana e evaporar em Banho Maria (45ºC) até secura (+/- 25-40min).
• Levar o resíduo da cápsula com 0,2 mL de clorofórmio para eliminação da clorofila, ainda no BM°.
• Redissolver o resíduo da cápsula com 1 mL de etanol 70% e tranferí-lo para um tubo de ensaio.
• Adicionar 200 mg de magnésio em pó ou raspas no tubo.
• Verter cuidadosamente, pelas paredes do tudo inclinado, cerca de 1 mL de HCl concentrado (CUIDADO! Pode ocorrer projeções, reação exotérmica).
• Observar a coração, esperando-se que se desenvolva uma coloração róseo-avermelhada.

Realizar esta técnica com padrão de quercetina dissolvido em q.s. de etanol.

REAÇÃO POSITIVA (COM COR)	REAÇÃO NEGATIVA (SEM COR)
-Flavona – amarelo a vermelho -Flavonol – vermelho a vermelho-sangue -Dihidroflavonol – vermelho a vermelho-sangue -Flavanona – vermelho a violeta -Deriv. Antociânicos – vermelho para rosa	-Chalconas -Auronas -Dihidrochalconas -Isoflavonas -Isoflavononas

Deve aparecer coloração vermelha, quanto mais intensa a cor, maior a concentração dos flavonoides.

Drogas vegetais
Achyrocline satureioides (capítulos florais): marcela
Baccharis trimera (folhas): carqueja

Apostila de Aula Prática de Farmacognosia UFBA

Influência do pH nas Antocianidinas

Comportamento de pigmentos vegetais em relação ao pH das soluções.

A cor dos pigmentos vegetais está associada à sua estrutura química, e a sua coloração em meio ácido ou básico dependerá justamente das modificações ocorridas na molécula do pigmento, quando o mesmo é submetido a diferentes valores de pH.

Clorofilas, flavonoides e betalaínas são compostos sensíveis à mudanças de pH das soluções. Na clorofila a cor em meio ácido passa a verde oliva e em meio alcalino a verde brilhante.

Antocianinas tem cor vermelha intensa a valores de pH baixos. À medida que o pH aumenta a coloração passa a violeta.

Extrato da casca de uva

Extraído com água ou soluções alcoólicas da casca de uva vermelho escura, este extrato, dependendo da variedade, contém até 25 pigmentos diferentes. O corante é frequentemente denominado enocianina, e seu principal cromóforo presente na casca de uva é a mistura complexa de antocianinas: antocianidina (aglicona), açúcar e frequentemente ácidos. Na natureza, as antocianinas sempre ocorrem na forma heteroglicosídica, contendo uma ou mais moléculas de açúcar e da aglicona antocianidina. São solúveis em água e em mistura de água e álcool, porém insolúveis em óleos e gorduras.

Diferentes monossacarídeos (glicose, galactose, ramanose, arabinose), dissacarídeos e trissacarídeos também podem ser encontrados. Em alguns casos, o açúcar é acilado com os ácidos ferrúlico, cafeico e p-cumárico. A presença do grupo glicosídico na posição 3 confere maior estabilidade, sendo a forma diglicosídica mais estável ao aquecimento e à luz que a monoglicosídica, e a presença do grupo hidroxila na posição 3 aumenta a sensibilidade do composto à degradação.

O núcleo flavilium da antocianina é deficiente em elétrons e, portanto, altamente reativo. A sua reação geralmente envolve descoloração do pigmento, sendo, portanto, indesejável no processamento de frutas e vegetais.

Corantes comerciais derivados de uvas têm tido considerável sucesso em bebidas, mas todas as antocianinas convencionais apresentam algum tipo de limitação. Estabilidade é um problema, já que as antocianinas são degradadas na presença de metais, ácido ascórbico, açúcar, oxigênio, temperatura e enzimas.

A sensibilidade ao pH é fator limitante em várias situações, afetando a cor e a estabilidade química, descolorindo em valores de pH acima de 4,0. Em soluções ácidas, a antocianina é vermelha, mas com o aumento do pH a intensidade da cor diminui. Em solução alcalina, a cor azul é obtida, sendo porém instável. Para aplicação geral, o pH entre 1,0 e 3,5 confere maior estabilidade.

São utilizadas em bebidas ácidas, geleias, doces e cosméticos. A adição de ácido ascórbico para efeito de estabilização não é recomendada, e a presença de açúcares, especialmente a frutose, acelera o processo de escurecimento. Além do pH (principal responsável pela estabilidade das antocianinas), outros fatores contribuem para sua degradação.

• Sulfito - O dióxido de enxofre, utilizado na prevenção do escurecimento e crescimento microbiológico, promove a descoloração da antocianina, por sua adição na posição 2 ou 4. A cor, entretanto, pode ser regenerada por acidificação e aquecimento do produto para remover o dióxido de enxofre. Entretanto, alta concentração de sulfito (> 10 gramas/ kg) provoca destruição irreversível da antocianina para chalconas.

• Metais - As antocianinas, que possuem sistema 0-düdroxilado (anel B), complexam-se com metais, alterando sua coloração. Estes complexos são mais estáveis aos efeitos do pH e da luz que os compostos similares. Cianidina-3-glicosídica na presença de alumínio em pH 5,5 forma um complexo vermelho e, em presença de sais de ferro em pH acima de 5,5, um complexo azul. O aparecimento da coloração azulada em pêssegos enlatados é devido à complexação com zinco, sendo a perda da coloração rósea em pêras em razão do complexo cianidina-zinco.

Prática

Objetivo: Verificar o comportamento da coloração das antocianinas frente a mudanças de valores de pH.

Material de uso comum

• HCl concentrado  
• HCl 5%  
• NaOH 50%  
• NaOH 5%  
• NaCl  
• FeCl₃  
• Sulfito de sódio a 10%  
• Etanol

Material por grupo

• Tubos de ensaio  
• Pipeta graduada 5 mL  
• Gral com pistilo

Influência do pH

Triturar em gral cascas de uva roxa, utilizando uma mistura de 5 mL água e 5 mL de álcool para facilitar a extração do pigmento, filtrar e transferir 1 mL para 6 tubos de ensaio numerados de 1 a 6.

Adicione os reagentes conforme descrito abaixo e verifique as mudanças de coloração ocorrida durante a prática e anotando o pH para cada tubo de ensaio:

• No tubo n.º 01 adicione 1 mL de HCl conc.;
• No tubo n.º 02 adicione 1 mL de HCl 5%;
• No tubo n.º 03 não adicione nada;
• No tubo n.º 04 adicione 1 mL de NaCl;
• No tubo n.º 05 adicione 1 mL de NaOH 50%;
• No tubo n.º 06 adicione 1 mL de NaOH 5%.

Influência do Sulfito.

Tome 1 mL do extrato hidroalcoólico da uva e transfira para um tubo de ensaio. Adicione 1 mL de sulfito de sódio. Observar a coloração.

Influência de Metais.

Tome 1 mL do extrato hidroalcoólico da uva e transfira para um tubo de ensaio. Adicione 1 mL de cloreto férrico. Observar a coloração.

Avaliação

• Desenhe a estrutura da antocianidina
• Represente a estrutura das antocianidina nos diferentes pHs testados (neutro, ácido e básico).
• Cite mais três pigmentos de origem natural e suas aplicações na indústria farmacêutica e de alimentos.

Referências bibliográficas

• ARAÚJO, Júlio M. A. Química de Alimentos. Universidade Federal de Viçosa. 1995
• BOBBIO, Florinda O; Bobbio, Paulo A. Manual de Laboratório de Química de Alimentos. São Paulo. Livraria Varela. 1995.
• COSTA, Aloísio F. Farmacognosia, vol. 2, 1978.
• Farmacopéia Brasileira, 3ª edição.